海洋天然微生物次級代謝產物的研究進展
前言
天然產物是指動物、植物提取物、或昆蟲、海洋生物及微生物體內的組成成分或其次級代謝產物的統稱。主要包括蛋白質、多肽、氨基酸、各種酶、單糖、寡糖、多糖、微生物、萜類、生物鹼及抗生素等多種天然存在的化學成分。抗生素是微生物在新陳代謝過程中產生的以低微濃度抑制他種微生物生長、甚至可以殺死他種微生物的化學物質。在人類預防和治療微生物感染疾病方面具有非常重要的作用。自青黴素發現以來，利用微生物開發天然產物作為臨牀用藥，廣泛用以抗真菌、抗細菌、抗腫瘤。
1.微生物中天然產物發掘策略
微生物作為天然產物的重要來源，具備以下優勢：1，資源豐富，挖掘潛力大，發現新藥效率高；2，獨特的骨架使得化學合成難度大；3，生長週期短，易於操作控制，工業化潛力大；4，可通過闡明的生物合成途徑定向改造以提升產率及新藥的衍生。然而，目前僅有總數1%的微生物被人們認知且在實驗條件下可培養，這就意味着更多的微生物有待科研工作者去開發和研究。微生物中天然產物的發掘策略主要通過兩種途徑：傳統天然產物發現策略和基於基因組的發掘策略。前者主要通過對微生物的菌種及培養條件的變化來刺激微生物產生不同的天然產物，這種策略的缺點在於具有一定的盲目性，完全為非靶向，無法預知產物的類型。後者隨着基因測序技術的發展，現已成為微生物天然產物發現的主要方法，通過生物信息學分析基因組序列及控制天然產物合成的基因簇並對其進行基因水平改造以產出預期的天然產物，並闡明其生物合成途徑。該策略靶向發現，高效合成，具有非常好的發展前景。
1.1 傳統天然產物發掘策略
該策略主要基於活性導向、質譜導向等天然產物的傳統手段分離，原理是菌種及培養基水平的變化引起次級代謝產物的變化。無需基因測序及複雜的遺傳操作，該策略在發掘微生物天然產物初期取得了非常顯著的成效，然而隨着大量微生物資源的被開發，產物的重複分離愈發常見。目前通過該方法仍可發現一些新穎活性的天然產物。
1.1.1 新的微生物物種
微生物存在於地球的各個角落，在一些極端特殊環境中存在着嗜熱、嗜冷、抗酸、耐鹽鹼等特殊細菌，獨特的生長環境意味着不同的代謝機制產生不同於其他環境的次級代謝產物，具有發現新穎結構的潛力。
1.1.2 OSMAC篩選策略
OSMAC （one strain many compounds）策略通過改變培養基的類型、發酵條件（温度、pH值）、添加小分子等方法，以期望改變微生物的代謝方式進而產生不同的次級代謝產物。其原理是通過改變可能對微生物代謝產生影響的條件，但缺點在於盲目性較強，代謝方向無法控制，其具體原理機制無法闡明。但由於某些沉默基因簇可在特殊條件下表達或者過表達，因此OSMAC策略可篩選出用於基因組指導下的天然產物。
1.1.3 活性導向和高通量篩選
高通量篩選主要為了從大量微生物資源中篩選出具有研究意義的菌株，然而隨着微生物資源的開發，大部分含量高且易獲得的活性物質已被分離鑑定且其合成路徑也已有較為深入的研究。針對其他含量較低、不易發現且活性較好的新成分就需要用到更加靈敏的技術。LC-MS技術及LC-NMR技術的出現可為其提供方便，前期可通過活性導向或紫外光譜技術對其粗提物進行初篩，後續利用LC-MS及LC-NMR對粗提物進行分析，並利用生物信息學網站例如GNP對其結果進行分析，並對其中活性物質進行靶向分離鑑定。該方法目的性較強，避免低含量活性物質的遺漏，近幾年已取得較好的研究成果。
1.1.4 共生培養
微生物共培養是一種有效增加次級代謝產物多樣性的策略。共培養條件下，微生物分泌抗生素、激素分子、分泌物之間相互影響對新化合物的產生及控制化合物合成的基因簇的代謝均有影響。
1.2 基於基因組的發掘策略
1.2.1 生物信息學分析預測產物和底物結構
生物信息學工具是分析基因組序列信息以及鑑定基因簇功能信息不可缺少的工具，經過16S rDNA測序並進行BLAST分析，Mega 軟件構建進化樹鑑定微生物的菌種信息，生物合成基因及基因簇分析常用工具為antiSMASH在線分析網站。通過比較目標基因簇與已知基因簇相似性，同源性較高的可預測其產物的大致結構類型，提高分離效率。分析目標基因簇可預測底物類型，可通過添加同位素標記底物追蹤該基因簇合成的化合物。
1.2.2 體外重構合成
體外重構即底物與一個或者幾個合成酶體外反應從而獲得相應的代謝產物的方法。僅適用於相對簡單的生物合成途徑，不適用於多合成基因控制的複雜合成途徑。
1.2.3 基因敲除與異源表達
對於那些與已知基因簇相似度較低的目標基因簇往往可能控制合成結構新穎的化合物，因此可通過基因敲除或異源表達比較其代謝譜圖的差異，例如構建基因失活菌株阻斷其產物的合成相同條件下與野生菌株HPLC譜圖的差異，對其差異物進行追蹤鑑定。而異源表達則是比較轉入外源基因的宿主菌與原始菌株代謝譜圖的差異。該方法僅適用於低相似性、較高表達的基因簇，不適用於沉默基因簇。
1.2.4 沉默基因簇的激活
以上策略適用於能夠轉錄表達的生物合成基因簇代謝產物的發現，對於基因簇低表達或者不表達的情況下，則需要不同的挖掘策略。通過替換啟動子，比較與原始代謝圖譜的差異獲得相應的代謝產物，該方法需要準確鑑定天然啟動子的位置。過量表達正向調控基因或者敲除負調控基因也可能激活沉默的基因簇，次級相應的次級代謝產物的產生。真菌中沉默基因的激活可通過添加組蛋白去乙酰化酶抑制劑或DNA甲基轉移酶抑制劑改變染色質構型從而激活沉默基因簇的表達。
2.生物合成途徑
微生物來源的天然產物主要由聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）和非核糖體多肽類化合物（nonribosomal peptide synthase, NRPS）以及PKS/NRPS雜合的代謝途徑形成的。
2.1 PKS
PKS生物合成途徑中聚酮合酶的催化過程與脂肪酸合酶的催化過程類似，目前主要分為三種類型的PKS。
2.1.1 PKS Ⅰ型
PKS Ⅰ型合酶，又稱為模塊式合酶，一般具有多個模塊且每個模塊在合成過程中不重複使用。模塊中基本結構域包括：酮基合酶結構域（ketosynthase, KS），酰基轉移酶結構域（acyltransferase, AT）和酰基載體蛋白結構域（acylcarrier protein, ACP），其中AT負責底物的識別，KS負責底物與上一步ACP上的聚酮鏈進行克萊森縮合反應，進行碳鏈的進一步延伸，延伸完成後轉移到該步的ACP結構域，完成一輪碳鏈延伸。此外，該模塊中可能含有其他修飾酶如：KR、ER、DH、MT等在加載到KS結構域時對碳鏈進行修飾。當聚酮鏈完成所有延伸後，硫脂酶結構域（TE）進行反應終止和產物的釋放，再經過環化或修飾成為最終的代謝產物。
2.1.2 PKS Ⅱ型
PKS Ⅱ型合酶，又稱為迭代式，產物多為芳香族化合物，含有多個單功能酶，是一類多功能酶複合體，每個酶在合成過程中都可以重複使用，至少包括KSα、KSβ和ACP三個功能結構域。其中KSα表現出縮合反應活性，KSβ作為鏈長起始因子，ACP仍為酰基載體蛋白。多由乙酰CoA作為起始單元經過重複催化形成β-酮乙基聚合鏈，再經過KR、芳香化酶或環化酶催化形成結構多樣性的產物。目前並未發現負責將聚合鏈從模塊上脱落的TE酶。
2.1.3 PKS Ⅲ型
該類型的研究相對較少，這類型的合酶是一種可重複利用的同源二聚體酶，在缺乏ACP的情況下直接催化泛肽輔酶A之間的脱羧縮合反應。
2.2 NRPS
非核糖體多肽類化合物的生物合成途徑多以非蛋白質氨基酸為底物，經過NRPS催化形成非核糖體肽類化合物。NRPS合成酶類似PKS Ⅰ合酶催化機制，含有多個模塊，每個模塊含有三個基本的功能結構域：縮合結構域（C domain）、腺苷酰化結構域（A domain）和肽酰基載體蛋白結構域（PCP，又稱為巰基化結構域，T domain）。A負責氨基酸底物的識別，活化並轉移至PCP形成氨酰硫脂。C結構域負責將其與上游模塊中PCP結構域中的肽鏈進行縮合形成肽鍵。有些模塊中還含有異構化酶結構域（epimerization, E）、環化酶結構域（cyclization, Cy）和甲基化結構域（methyltransferase, MT）等對增加的氨基酸進行修飾。主要合成過程為起始氨基酸經起始模塊A-PCP加載至NRPS上經過延伸模塊C-A-PCP將氨基酸底物與上游PCP上的氨酰硫脂進行縮合形成肽鍵，最終由TE或其他結構域完成產物的解離釋放，再經過環化修飾形成最終的NRP產物。
2.3 PKS/NRPS雜合途徑
除上述合成途徑以外還存在雜合型的PKS/NRPS途徑，是一種PKS與NRPS共存在的一種複合酶，其催化方式與各自的PKS和NRPS催化方式相同。雜合方式包括PKS/NRPS, PKS/NRPS/PKS, NRPS/PKS/NRPS等雜合途徑。在雜合酶的交界處，一般由下游的C結構域或者KS結構域催化上游的ACP-聚酮鏈或PCP-肽酰硫脂轉移至下游的C結構域或者KS結構域上。