海洋天然微生物次级代谢产物的研究进展
前言
天然产物是指动物、植物提取物、或昆虫、海洋生物及微生物体内的组成成分或其次级代谢产物的统称。主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、各种酶、单糖、寡糖、多糖、微生物、萜类、生物碱及抗生素等多种天然存在的化学成分。抗生素是微生物在新陈代谢过程中产生的以低微浓度抑制他种微生物生长、甚至可以杀死他种微生物的化学物质。在人类预防和治疗微生物感染疾病方面具有非常重要的作用。自青霉素发现以来，利用微生物开发天然产物作为临床用药，广泛用以抗真菌、抗细菌、抗肿瘤。
1.微生物中天然产物发掘策略
微生物作为天然产物的重要来源，具备以下优势：1，资源丰富，挖掘潜力大，发现新药效率高；2，独特的骨架使得化学合成难度大；3，生长周期短，易于操作控制，工业化潜力大；4，可通过阐明的生物合成途径定向改造以提升产率及新药的衍生。然而，目前仅有总数1%的微生物被人们认知且在实验条件下可培养，这就意味着更多的微生物有待科研工作者去开发和研究。微生物中天然产物的发掘策略主要通过两种途径：传统天然产物发现策略和基于基因组的发掘策略。前者主要通过对微生物的菌种及培养条件的变化来刺激微生物产生不同的天然产物，这种策略的缺点在于具有一定的盲目性，完全为非靶向，无法预知产物的类型。后者随着基因测序技术的发展，现已成为微生物天然产物发现的主要方法，通过生物信息学分析基因组序列及控制天然产物合成的基因簇并对其进行基因水平改造以产出预期的天然产物，并阐明其生物合成途径。该策略靶向发现，高效合成，具有非常好的发展前景。
1.1 传统天然产物发掘策略
该策略主要基于活性导向、质谱导向等天然产物的传统手段分离，原理是菌种及培养基水平的变化引起次级代谢产物的变化。无需基因测序及复杂的遗传操作，该策略在发掘微生物天然产物初期取得了非常显著的成效，然而随着大量微生物资源的被开发，产物的重复分离愈发常见。目前通过该方法仍可发现一些新颖活性的天然产物。
1.1.1 新的微生物物种
微生物存在于地球的各个角落，在一些极端特殊环境中存在着嗜热、嗜冷、抗酸、耐盐碱等特殊细菌，独特的生长环境意味着不同的代谢机制产生不同于其他环境的次级代谢产物，具有发现新颖结构的潜力。
1.1.2 OSMAC筛选策略
OSMAC （one strain many compounds）策略通过改变培养基的类型、发酵条件（温度、pH值）、添加小分子等方法，以期望改变微生物的代谢方式进而产生不同的次级代谢产物。其原理是通过改变可能对微生物代谢产生影响的条件，但缺点在于盲目性较强，代谢方向无法控制，其具体原理机制无法阐明。但由于某些沉默基因簇可在特殊条件下表达或者过表达，因此OSMAC策略可筛选出用于基因组指导下的天然产物。
1.1.3 活性导向和高通量筛选
高通量筛选主要为了从大量微生物资源中筛选出具有研究意义的菌株，然而随着微生物资源的开发，大部分含量高且易获得的活性物质已被分离鉴定且其合成路径也已有较为深入的研究。针对其他含量较低、不易发现且活性较好的新成分就需要用到更加灵敏的技术。LC-MS技术及LC-NMR技术的出现可为其提供方便，前期可通过活性导向或紫外光谱技术对其粗提物进行初筛，后续利用LC-MS及LC-NMR对粗提物进行分析，并利用生物信息学网站例如GNP对其结果进行分析，并对其中活性物质进行靶向分离鉴定。该方法目的性较强，避免低含量活性物质的遗漏，近几年已取得较好的研究成果。
1.1.4 共生培养
微生物共培养是一种有效增加次级代谢产物多样性的策略。共培养条件下，微生物分泌抗生素、激素分子、分泌物之间相互影响对新化合物的产生及控制化合物合成的基因簇的代谢均有影响。
1.2 基于基因组的发掘策略
1.2.1 生物信息学分析预测产物和底物结构
生物信息学工具是分析基因组序列信息以及鉴定基因簇功能信息不可缺少的工具，经过16S rDNA测序并进行BLAST分析，Mega 软件构建进化树鉴定微生物的菌种信息，生物合成基因及基因簇分析常用工具为antiSMASH在线分析网站。通过比较目标基因簇与已知基因簇相似性，同源性较高的可预测其产物的大致结构类型，提高分离效率。分析目标基因簇可预测底物类型，可通过添加同位素标记底物追踪该基因簇合成的化合物。
1.2.2 体外重构合成
体外重构即底物与一个或者几个合成酶体外反应从而获得相应的代谢产物的方法。仅适用于相对简单的生物合成途径，不适用于多合成基因控制的复杂合成途径。
1.2.3 基因敲除与异源表达
对于那些与已知基因簇相似度较低的目标基因簇往往可能控制合成结构新颖的化合物，因此可通过基因敲除或异源表达比较其代谢谱图的差异，例如构建基因失活菌株阻断其产物的合成相同条件下与野生菌株HPLC谱图的差异，对其差异物进行追踪鉴定。而异源表达则是比较转入外源基因的宿主菌与原始菌株代谢谱图的差异。该方法仅适用于低相似性、较高表达的基因簇，不适用于沉默基因簇。
1.2.4 沉默基因簇的激活
以上策略适用于能够转录表达的生物合成基因簇代谢产物的发现，对于基因簇低表达或者不表达的情况下，则需要不同的挖掘策略。通过替换启动子，比较与原始代谢图谱的差异获得相应的代谢产物，该方法需要准确鉴定天然启动子的位置。过量表达正向调控基因或者敲除负调控基因也可能激活沉默的基因簇，次级相应的次级代谢产物的产生。真菌中沉默基因的激活可通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂或DNA甲基转移酶抑制剂改变染色质构型从而激活沉默基因簇的表达。
2.生物合成途径
微生物来源的天然产物主要由聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）和非核糖体多肽类化合物（nonribosomal peptide synthase, NRPS）以及PKS/NRPS杂合的代谢途径形成的。
2.1 PKS
PKS生物合成途径中聚酮合酶的催化过程与脂肪酸合酶的催化过程类似，目前主要分为三种类型的PKS。
2.1.1 PKS Ⅰ型
PKS Ⅰ型合酶，又称为模块式合酶，一般具有多个模块且每个模块在合成过程中不重复使用。模块中基本结构域包括：酮基合酶结构域（ketosynthase, KS），酰基转移酶结构域（acyltransferase, AT）和酰基载体蛋白结构域（acylcarrier protein, ACP），其中AT负责底物的识别，KS负责底物与上一步ACP上的聚酮链进行克莱森缩合反应，进行碳链的进一步延伸，延伸完成后转移到该步的ACP结构域，完成一轮碳链延伸。此外，该模块中可能含有其他修饰酶如：KR、ER、DH、MT等在加载到KS结构域时对碳链进行修饰。当聚酮链完成所有延伸后，硫脂酶结构域（TE）进行反应终止和产物的释放，再经过环化或修饰成为最终的代谢产物。
2.1.2 PKS Ⅱ型
PKS Ⅱ型合酶，又称为迭代式，产物多为芳香族化合物，含有多个单功能酶，是一类多功能酶复合体，每个酶在合成过程中都可以重复使用，至少包括KSα、KSβ和ACP三个功能结构域。其中KSα表现出缩合反应活性，KSβ作为链长起始因子，ACP仍为酰基载体蛋白。多由乙酰CoA作为起始单元经过重复催化形成β-酮乙基聚合链，再经过KR、芳香化酶或环化酶催化形成结构多样性的产物。目前并未发现负责将聚合链从模块上脱落的TE酶。
2.1.3 PKS Ⅲ型
该类型的研究相对较少，这类型的合酶是一种可重复利用的同源二聚体酶，在缺乏ACP的情况下直接催化泛肽辅酶A之间的脱羧缩合反应。
2.2 NRPS
非核糖体多肽类化合物的生物合成途径多以非蛋白质氨基酸为底物，经过NRPS催化形成非核糖体肽类化合物。NRPS合成酶类似PKS Ⅰ合酶催化机制，含有多个模块，每个模块含有三个基本的功能结构域：缩合结构域（C domain）、腺苷酰化结构域（A domain）和肽酰基载体蛋白结构域（PCP，又称为巯基化结构域，T domain）。A负责氨基酸底物的识别，活化并转移至PCP形成氨酰硫脂。C结构域负责将其与上游模块中PCP结构域中的肽链进行缩合形成肽键。有些模块中还含有异构化酶结构域（epimerization, E）、环化酶结构域（cyclization, Cy）和甲基化结构域（methyltransferase, MT）等对增加的氨基酸进行修饰。主要合成过程为起始氨基酸经起始模块A-PCP加载至NRPS上经过延伸模块C-A-PCP将氨基酸底物与上游PCP上的氨酰硫脂进行缩合形成肽键，最终由TE或其他结构域完成产物的解离释放，再经过环化修饰形成最终的NRP产物。
2.3 PKS/NRPS杂合途径
除上述合成途径以外还存在杂合型的PKS/NRPS途径，是一种PKS与NRPS共存在的一种复合酶，其催化方式与各自的PKS和NRPS催化方式相同。杂合方式包括PKS/NRPS, PKS/NRPS/PKS, NRPS/PKS/NRPS等杂合途径。在杂合酶的交界处，一般由下游的C结构域或者KS结构域催化上游的ACP-聚酮链或PCP-肽酰硫脂转移至下游的C结构域或者KS结构域上。